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產品課堂

淺析低密度探針陣列TaqMan Array Card在生物醫學實驗中的應用-中

應用驅動型qPCR儀選型攻略-9 


三、如何設計TaqMan Array Card的布局方案 

       TaqMan 陣列卡分為庫存TAC(Inventoried TaqMan Array Card)和定制型TAC(Custom TaqMan Array Card)兩類。 

       庫存TAC針對特定應用在卡上已包被有12-381個測定靶標的TaqMan探針和引物組,無需用戶設計靶標排布,可以直接使用獲得高度可重復的結果。庫存TAC有胃腸道感染病原體檢測TAC、呼吸道感染病原體檢測TAC、基因表達研究TAC、miRNA研究TAC等。 

       定制型TAC,顧名思義,實驗者須根據實驗要求確定檢測靶標種類、數量、單個靶標的技術重復數和陽性對照靶標設置,確定TAC上靶標陣列分布圖。TAC樣品技術重復有重復1次(singlet/no replicates)、2次(duplicates)、3次 (triplicates)和4次(quadruplicates)可選。同一靶標技術重復孔內的引物-探針組成分完全一致。 

       我們先來了解一下ABI庫存的標準化TAC陣列排布設置原理。 

1)Format 16、Format 32和Format 64三款TAC,每個樣品的每種靶標為3次技術重復。


QuantStudio 6 Pro Format 16 TaqMan Array card.jpg 

       Format 16 TAC示意圖中,左右兩列藍色數字分別8個上樣通道。16代表該款TAC可檢測靶標的種數共16種。

       由于檢測數據質控和數據分析歸一化要求,每張卡必須至少預留一個強制性地內參對照靶標(Mandatory Manufacturing Control),這樣Format 16實際可測靶標種數為15個(Target Assays)。Format 16卡上每個靶標3個復孔,16×3=48孔,所需反應孔數剛好占滿一個通道48孔。整張卡可測試8個不同樣品。

 

2)Format 32 TAC,用于測試1個對照靶標+31個測試靶標,每種靶標3次技術重復,所需反應孔數為32×3=96個,一個樣品需占用2個檢測通道(即2×48孔),每張卡只能測試4個樣品。

QuantStudio 7 Pro Format 32 TaqMan Array card.jpg

 

3)Format 64卡,用于測試1個對照靶標+63個測試靶標,每種靶標設3個復孔,所需反應孔總數為64×4=192個,一個樣品占用4個檢測通道(4×48孔,即圖中Port 1-4),每張卡只能測2個樣品,樣品通量為Format 32卡的一半。

QuantStudio 6 Flex Format 64 TaqMan Array card.jpg

 

 

       要提高檢測效率并降低成本,最直接辦法是把技術重復數量降低。

       如Format 24,每個樣品可測試靶標種數達到23種,每種靶標2個技術重復,每張TAC可測試8個樣品。4342249貨號一個包裝可滿足80個動物測試。如需篩選的靶標種數多達數十甚至上百種,為便于后期數據分析,采用Format 48、Format 96a、Format 384 卡,一個靶點一個孔,或用2-3塊板來完成技術重復,無疑十分便利。

QuantStudio 7 Flex Format 24 TaqMan Array card.jpg 

       基于以上TAC陣列排布規律和特點,我們來看2個兩個實例。一個Human Inflammation Array (P/N 4378707) 庫存TAC,一個定制TAC。 

QuantStudio 6 Pro實時熒光定量PCR儀Format 96A 炎癥基因表達TAC.jpg

        Human Inflammation Array卡上共96種靶標(其中18S為對照),每個樣品占用2個上樣通道,相當于Format 96a的布局(每靶標4個技術重復)。

        TaqMan Array Card for 19 Enteropathogens即本文提到的美國弗吉尼亞大學開發的腸道病原體檢測TAC,是學術界TAC網紅。 

實時熒光定量PCR腸道病原體檢測TAC.jpg

       該TAC可測試靶標種數共24種,理論上可以實現每個靶點2個技術重復,相當于Format 24。但實際上,它可檢測19種常見腸道病原體的23種靶標,其中15種病原體為單靶點檢測,另4種病原體為雙靶點檢測。 

       它的對照設置有特點:質控對照18S、臨床樣本陽性對照16S均為singlet;采用了Combined positive controls對照,是針對病毒、細菌靶點分別設置了DNA、RNA陽性對照。 

       技術重復設置上與標準格式有區別:病原體中Norovirus GII、C. difficile、Trichuris、Ascaris、STEC stx1和STEC stx2用的是singlet,其余病原體靶點統一為2個技術重復(并非常規qPCR中同一個樣品三個復孔法)。 

       再如嚙齒動物TaqMan Array MicroRNA A+B Card,每張TAC包含384個TaqMan MicroRNA分析,能在5小時內完成的641個microRNA測定。每個陣列包括三個物種內源性對照及一個與嚙齒動物無關的TaqMan MicroRNA靶點作為陰性對照。 

       上述兩個TAC案例提示我們:不同應用類型、不同樣品,對照靶標設置要求不完全一致。技術重復的多少、對照的設置因實驗目的和樣品異,是實驗者需要斟酌的,事關數據可靠性和TAC靶位陣列整體布局安排。 

(待續)

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