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產品課堂

瞬息涼炎代謝頻——動物能量代謝分析系統消除水蒸氣稀釋效應的技術途徑(下)

 (續:瞬息涼炎代謝頻——動物能量代謝分析系統消除水蒸氣稀釋效應的技術途徑-上篇)

三、討論

       通常,動物能量代謝監測系統分別采集測試籠內氣體(測試氣樣)、室內空氣(對照氣樣),對比兩組氣體中O2、CO2各自含量變化來測算一定時間內代謝所消耗的氧氣VO2和產生的二氧化碳VCO2。
       籠內氣體經過呼吸氣體交換后,在部分O2被消耗的同時,動物呼出的CO2+H2O總量更多,不僅填補了損耗O2的體積虧空,還促進待測氣體總量和總體積的凈增長。理論上,最終輸送至O2、CO2氣體分析儀的測試氣體流量(輸出流量)要大于對照氣體、輸入氣體的流量。如此,方可確保輸出氣流載入的氣體與輸入氣流具有等效性,真實、準確地衡量初始輸入氣流與代謝后輸出氣流中CO2、O2含量實際發生的變化。
       為確保輸入、輸出氣流組分的等效性,需設定采樣內部參照標準(內參)。內參氣體須在呼吸交換前后自身總量維持穩定,根據阿伏伽德羅定律,其總體積自然保持恒定??諝庵械腘2等不參與呼吸代謝交換的氣體組份,無疑是最簡便、最可靠的內參選擇。系統無須增加專用的氣體傳感器,利用系統自帶的高精度O2、CO2和水蒸氣氣體分壓測定值,采用道爾頓氣體分壓原理和系統已知的標準采樣流量,即可間接測算出N2等非代謝氣體的總體積。將N2總體積在對照氣體(等效于輸入氣體)、實際采集合測試氣體(非理論輸出體積)中體積的比值作為校準因子,結合實際測試采樣中O2、CO2氣體分壓數據,即可還原理論輸出氣體中O2、CO2各自含量或體積,從而實現了輸入、輸入氣流的兩種氣體含量的準確測定。Sable Promethion Core系統中采用的正是這一思路實現測試采樣氣體流量的校正。這一流量校正方法,水蒸氣不僅無須凈化,反而是盡力保全的重點測試對象之一。其間,離不開氣壓分析儀和水蒸氣分壓測定。毫無疑問,基于水O2、CO2和水蒸氣的氣體分壓測定和體系中非代謝氣體N2質量守恒原理創立的測試輸出氣流一步式補償校正方法,是一個簡便精準O2、CO2測定的解決方案。
       換個角度看,無是測試氣流、對照氣流,無非都是由水蒸氣和非水蒸氣組分兩部分構成的。對于先除濕后檢測的動物能量代謝分析系統,如Columbus CLAMS、TSE PhenoMaster NG等,假設對照空氣中水蒸氣體積占比0.03%,實際采樣測試氣流的水蒸氣體積占比2.03%,則干燥處理后,對照氣體、測試氣體剩余非水蒸氣類氣體的總量分別相當于處理前的99.7%和97.97%。以對照氣體非水蒸氣組份氣體為參照,則測試采樣氣流量只相當于對照氣流之98.26%,不具有等效性。當輸入氣體檢測艙時,測試氣樣被自然稀釋,造成O2、CO2測試誤差。因此,采用水蒸氣凈化處理的話,必需校正測試采樣氣流或同時對對照氣流實施流量校正控制。校正的標準是兩組氣體干燥后氣體的氣壓或氣體流量測定值的一致。采用的方法是在氣體凈化單元之后增加氣體校正單元,在干燥處理的同時,將測試氣流或同時對照氣流采取適當的采樣量補償控制,以確保被所剩余的非水蒸氣氣體組分含量等效性。而有效的補償采樣流量控制,不僅是測試結果可靠性的關鍵,還會增加系統結構之復雜性。
       可見,能量代謝分析系統中呼吸氣體交換率測定數據有效性、準確性的關鍵,不在于水蒸氣的稀釋效應有無和嚴重程度,而在于測試氣體采樣流量的精密校正機制。去除水蒸氣的稀釋效應,并非代謝氣體分析實驗的必然之路。
       結合本文前面的討論,可以認為:水蒸氣干燥處理并非動物能量代謝RER測定的必要條件。無論是TSE PhenoMaster NG系統的干燥-采樣流量校正方法,還是Sable Promethion Core測試氣體流量補償校正技術,只要補償的采樣氣體流量適度,都是可行的。另外,水蒸氣稀釋效應只是業內約定成俗的概念,其涵義不明確且存在片面性,實際上在動物能量代謝呼吸氣體的測定中不具有任何指導意義。因此,我們主張從采樣氣體流量校正技術方法角度,來理解和探討RER分析測試中不同品牌動物代謝氣體監測系統技術設計上的差異,似乎對開發、完善這類技術設備測試性能更有啟迪價值。


3.1 TSE PhenoMaster NG的低溫冷阱除濕法

       通常,冷阱的工作溫度越低,其捕獲水蒸氣的效能越高。常規實驗室小型凍干機的冷阱額定溫度,根據實驗樣品要求可在-20℃ ~ -104℃的大范圍內自由選擇。如德國Christ ALPHA 1-2LD Plus,冷凍擱板溫度可達-20℃,可實現最大凝冰效率2kg/24h。
       而動物能量代謝和行為表型分析系統,為確保呼吸交換氣體測試值、動物飲食飲水、動物行為狀態和模式監測等眾多代謝有關測試數據有效關聯,需氣體冷凝足夠高效,以改進代謝氣體監測數據產生上的延遲滯后現象,實現動物行為表型與RER監測數據的真正協調和同步化。
       低溫冷阱裝置在于室溫空氣熱交換的過程中持續對外散熱。額定工作溫度降低侯,制冷功耗和熱量排放和運行噪音水平均會水漲船高。但動物代謝監測實驗對環境的室內氣壓和溫度條件的穩定、室內噪音水平控制都都有特殊要求,以減少對測試動物代謝和行為表型的干擾。而這勢必會對選擇更低溫度冷阱形成制約。
       空氣熱傳導性相對較差,在冷阱冷凝性能不夠強悍的情況下,室溫水蒸氣冷凝干燥處理,若無足夠時間熱量交換時間,則水蒸氣凈化效能難以保證。這使得提升系統監測數據實時同步化表現,面臨極大的困難。
       TSE PhenoMaster NG采用低溫冷阱除濕方法的優勢是:運行過程中的低維護、免耗材。 


3.2 Columbus CLAMS的化學洗滌除濕法

       CLAMS Oxymax模塊除水蒸氣用的是Drierite品牌帶CoCL2指示劑的無水硫酸鈣填裝柱。水蒸氣氣流流過干燥住的過程耗時相對較長,其次是水分子與干燥劑的吸附、解吸附過程是雙向變化的,在使用過程中,隨著有效吸附表面積的減少,水汽凈化柱效下降的問題。
       使用單根Drierite 干燥柱效用持續時間短。若兩根Drierite 干燥柱串聯使用在可將柱效持續時間延長到72小時。但隨之而來的問題是,串聯凈化柱的使用,必然使采樣氣體通過柱體的時間進一步延長。
       因此,與TSE PhenoMaster NG系統采用的冷阱除濕法類似,Columbus CLAMS系統的不僅會存在氣體監測數據與其它代謝關聯數據高度同步化的難題,還有可能加劇氣體監測數據與其他數據不同步現象。

哥倫布綜合實驗動物代謝監測系統CLAMS Oxymax氣體水蒸氣干燥處理單元.jpg

       Drierite凈化柱采用外置接入,使用維護經濟簡便,但需運行期間需定期檢查狀態活性狀態,以免影響除濕效果。
       干燥住中的指示劑容易CoCL2與測試籠內動物尿液尿素分解釋放的NH3會發生反應而變色。因此,在Drierite干燥柱前還需加裝氨氣捕獲阱(Ammonia Traps,主要成分為CuSO2·5H2O)保護水汽凈化柱。 


3.3 Sable Promethion Core之氣體流量補償校正法

       根據阿伏伽德羅定律(Avogadro's Hypothesis),相同溫度、相同氣壓下,氣體體積比等于物質的量之比(氣體體積與量成正比),或者說同溫同壓下相同體積的任何氣體含有相同的分子數。
       Sable公司基于代謝呼吸交換氣體中非水蒸氣組份氣體的量和體積變化規律,摒棄了對水蒸氣凈化排除處理的常規思維,運用CO2、O2和水蒸氣氣體分壓數據,計算代謝前后測試氣流非水蒸氣組分氣體體積的變化,運用簡單的計算方法校正測試采樣氣體流量,實現了CO2、O2氣體量、體積變化的精確測定。
       Promethion Core系統的測試采樣氣路中不使用水蒸氣化學洗滌柱,不等于Promethion Core系統絕對排除了氣體洗滌器技術的應用。
       實際上,CGF模塊安裝有氣體洗滌柱,專門用于對CO2、O2和水蒸氣監測傳感器的自動校正環節。校準時,除濕柱被切換到氣路中用于去除氣流中的水蒸氣(此時,標定水蒸氣分壓值為0)?;谕瑯拥脑?,分別采用CO2、O2氣體洗滌器柱去除氣流中的CO2、O2后,可實現氣體分析儀的CO2、O2歸詢價校正。


3.4 測試氣體流量校正方法應用對系統結構布局的影響
       動物能量代謝分析系統在呼吸交換氣體監測中對水蒸氣處置策略的不同,決定了系統是否需要在測試氣路中引入水蒸氣處理環節。而一經導入氣體除濕單元,為應對采樣氣流中水蒸氣所占氣體體積空缺后剩余氣體濃度稀釋產生的誤差,就得在測試采樣控制單元-氣體干燥單元流程后面額外增加一個氣體流量采集的調控實體模塊(如TSE PhenoMaster NG系統氣體流量校正控制單元),解決氣體干燥處理后有效測試氣體流量間差異問題。因此,采用水蒸氣凈化流量校正法的系統,各功能單元相互獨立,呈積木式、多模塊分散式布局,模塊間氣路和數據通訊傳輸線路縱橫交錯,需要大型控制機架來安裝承載各監測模塊。

Columbus CLAMS與Sable Promethion Core控制單元外形.jpg

       Promethion Core 系統的CGF控制單元的高度集成化,通過一套刀片式氣體壓力檢測模塊,基于CO2、O2和水蒸氣的氣壓數據,結合程序化算法自動校正采樣氣體流量,完成RER測算。
       該方法省去了物理、化學除濕環節時間消耗,氣體監測過程得到極大簡化,實現RER指標相關數據以及動物各細微動作行為表型、動物狀態的高度同步化。結合SableHD高分辨采樣技術,提供高分辨率、采樣率和準確性的代謝和行為測量數據,特別有利于捕捉代謝率過程突然變化細節(如從靜息轉換到運動狀態),準確地記錄快速變化事件,便于研究者更清楚地掌握代謝和行為的精細過程。此外,還降低了常規化學試劑消耗與維護成本。
       Promethion Core 系統無須TSE PhenoMaster NG、Columbus CLAMS系統那樣使用復雜的水蒸氣凈化部件和校正控制組件,極大簡化整套系統布局結構,實現系統硬件小型化,節省實驗空間。


參考文獻

[1] Karl J. Kaiyala, Brent E. Wisse, John R. B. Lighton. Validation of an equation for energy expenditure that does not require the respiratory quotient. PLoS One. 2019; 14(2): e0211585.
[2] Lighton JR, Halsey LG. Flow-through respirometry applied to chamber systems: pros and cons, hints and tips. Comparative biochemistry and physiology. 2011. March;158(3):265–75.
[3] CLAMS Oxymax Model 2018 Hardware Setup Manual
[4] PhenoMaster Calorimetry Hardware Operating Instructions (PM15_HW_CaloSys_e_01)

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