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百家秘籍

赤橙黃綠青藍紫 誰持彩練當空舞——熒光強度檢測的多功能熒光酶標儀方案-上

基于應用的多功能熒光酶標儀選型-1

       相對于檢測比色皿、試管內樣品用的熒光光度計,人們把具有96、384、1536孔板的高通量熒光信號檢測功能的熒光檢測儀稱作熒光酶標儀或微孔板熒光讀板機。

       熒光(fluorescence)與發光(luminescence,包括化學發光、生物發光)的檢測用的都是能將極微弱光信號連續十倍放大、并轉換為可被測量電流的器件-光電倍增管(Photomultiplier Tube,PMT)。而發光反應,無須任何光源激發即可釋放光能。因此,熒光酶標儀通常天然地具備發光檢測功能。此外,再配上光柵單色器(monochromator)-光電二極管(Photodiode)檢測模塊,還可進行樣品200-850nm范圍光吸收峰掃描(spectral scanning)、任意波長的紫外可見光吸光度測定。這種同時具備熒光、發光和吸光度三種測定功能的熒光酶標儀,習慣稱之為多功能熒光酶標儀、多功能微孔板檢測儀、多模式微孔板讀板機(Multi-Mode Microplate Reader)。

       為滿足藥物靶點篩選、分子生物學應用、細胞信號轉導研究等分析要求,業內已開發的多功能熒光酶標儀,如BioTek Synergy Neo2,Molecular Devices SpectraMax iD5與SpectraMax i3x,BMG CLARIOstar Plus和Tecan infinite F Plex(200 Pro系列)等,無論是內部光路結構(波長選擇方式有濾光片式、雙光柵式、4光柵、光柵+濾光片組合式;檢測器類型有光電二極管+單PMT型,二極管+雙PMT型,二極管+4PMT型)。相應地,檢測功能也得到極大拓展。除熒光強度(Fluorescence intensity,FI)、紫外可見吸光度(UV-Vis absorbance,ABS)、熒光、發光基本功能,還增加了熒光偏振(Fluorescence polarization,FP)、時間分辨熒光(Time-resolved fluorescence,TRF)、熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)、生物發光共振能量轉移(Bioluminescence Resonance Energy Transfer,BRET)、均相時間分辨熒光(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence,HTRF),AlphaScreen & AlphaLISA等多種熒光分析方法)。讀數模式(由簡單的終點式Endpoint、動態讀取和光譜掃描, 擴充到逐孔多點掃描well area scanning、多波長掃描燈)、讀板方法(常規ABS、微孔板頂部讀取Top reading、微孔板底部讀取bottom reading)更多樣化。此外,為確保樣品測定狀態的穩定,往往還集成了樣品振蕩處理、檢測室溫度控制和細胞等特殊樣品通氣保護模塊。

       先進的光學元件、靈活的系統架構,加功能強大的數據采集與分析軟件,讓多功能熒光酶標儀在微量DNA/RNA及蛋白紫外純度濃度測定、ELISA/酶學動力學檢測、細胞活力和毒性觀測、激酶等藥物靶點分析、報告基因檢測等眾多領域獲得日益廣泛的應用。

       因此,用于熒光檢測的酶標儀選型,應充分結合實際分析技術類型和樣品的具體要求來考慮。本篇從最基礎的熒光強度測定入手,討論目前主流多功能熒光酶標儀的可選方案。

       就實現熒光強度測定的技術路線,多功能熒光酶標儀可分為經典型濾光片波長選擇系統(filter-based)和光柵單色器(monochromator-based)波長選擇系統兩種類型。

一、光柵型多功能熒光酶標儀

1.1 光柵型熒光酶標儀的特點

       這一類熒光酶標儀的熒光強度檢測,通常使用羅蘭凹面反射光柵基于光學衍射原理把白色復合光源分解成一系列連續、扇形排列的單色光譜區帶,再經狹縫選取其中特定光譜區間的單色光束用作熒光激發光照射樣本。同樣地,樣品發射的熒光,經光柵-狹縫選擇過濾后,其中特異波長范圍的光被輸送到PMT檢測器用于測定。光柵由步進電機驅動下轉動角度,被分解的單色光依次從狹縫出射,即可得到連續、不同波長的單色光。這種光柵系統結構簡單,選取的光波長范圍較窄,光色純正、雜散光少。                                              

Tecan Infinite E Plex多功能熒光酶標儀四光柵波長選擇光路系統.jpg

       光柵型熒光酶標儀的主要優勢有三點。

       首先是測試波長選擇具有極大靈活性。實驗者可分別針對不同熒光染料激發、發射光譜屬性,任意選擇最靈敏的測試波長。

       其次,單色器可以進行熒光光譜掃描(Spectrum)。光譜掃描檢測設置中,既可以固定激發波長(Excitation)而連續掃描樣品發射波長(Emission),獲得樣品在連續多個波長處的檢測峰值分布,也可以固定發射波長(Emission)而掃描樣品的激發波長(Excitation)峰。這特別有利于鑒定新的熒光物質或在某些分析中染料激發、發射波長遷移,對優化測試條件和改進測試性能具有重要價值。

       再次,是光柵單色器所提供的光譜帶寬普遍較窄。市面多數熒光檢測光柵提供的是5nm-20nm波長跨度的單色光。窄帶寬可確保光色純正,對具有窄發射峰的熒光探針(如Invitrogen Qdot這類納米熒光探針)的檢測和進行多色熒光檢測,可減少信號串擾,提高測試結果的特異性。

       凡事有利就有弊。

       由于眾多熒光染料的激發光和發射光光譜的分布在較寬泛的波長范圍。對這類熒光的檢測,較寬帶寬更有助于增強激發響應、熒光發射能量,往往改進熒光檢測靈敏度和獲得更低的檢測限。而無論是光柵光路的激發光,還是樣本釋放的發射熒光,與濾光片光路比,收窄的波長區帶,會造成激發或發生峰處于半峰寬(光譜峰高一半處的峰寬度稱半寬度,full width at half maxima/FWHM)以外范圍的光能損耗。

synergy NEO2多功能熒光酶標儀不同測試波長帶寬-信號強度對比.jpg

       光柵帶寬越窄,激發、發射熒光信號被濾掉的有效信號越多,必然在一定程度上降低檢測準確性和靈敏度。

       這一點在業內早有定論。

       只要將同一品牌、同一型號和同一臺機器上安裝的光柵光路和濾光片光路對同一個樣品熒光的檢測數據對比,即可清楚地證明。

表1 光柵光路與濾光片光路檢測靈敏度對比表

品牌型號

Tecan Infinite 200 PRO

Biotek Synergy H1

MD SpectraMax iD5

濾光片光路熒光頂讀靈敏度

85   amol/well

(Infinite E Plex,100μL/384孔板)

≤10 pM Fluorescein

(96-well plate)

≤2 pM Fluorescein

(96-well plate)

光柵光路的熒光頂讀靈敏度

170   amol/well

(Infinite E Plex,100μL/384孔板)

≤20 pM Fluorescein

(96-well plate)

≤4 pM Fluorescein

(96-well plate)

       正因為此,不僅是TRF、BRET、TR-FRET/HTRF、AlphaScreen & AlphaLISA等對熒光檢測靈敏度要求較高的分析,對檢測帶寬有特定要求化學發光DLR分析認證,都將光柵光路技術法拉黑剔除。

1.2 熒光強度檢測用的光柵型熒光酶標儀方案

       基于光柵單色器架構的熒光酶標儀,多見于中高端的多功能熒光酶標儀系統中。

       目前主流品牌多功能熒光酶標儀中,定位于熒光強度測定這一基礎功能的機型并不多。這其中有美國MD SpectraMax iD3,Tecan Infinite E Plex、PE Ensight等。

       光柵型熒光酶標儀的售價通常都顯著高于采用經典濾光片光路的同類產品。公開的信息表明,這類機型的市場價普遍均在35-40萬元區間。

       因此,若以熒光強度測定為主要目標,光柵型熒光酶標儀從價位上看未免過于昂貴。

(待續)

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