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百家秘籍

赤橙黃綠青藍紫 誰持彩練當空舞——雙熒光素酶報告基因檢測之多功能熒光酶標儀方案-下

基于應用的多功能熒光酶標儀選型-2

 (續:雙熒光素酶報告基因檢測之多功能熒光酶標儀解決方案-上)

二、DLR檢測對測試儀器性能的特殊要求

       在螢光素酶(如螢火蟲螢光素酶,海腎螢光素酶或NanoLuc螢光素酶)催化底物氧化的反應中,的確也存在420nm波長附近的發信號光峰,但整體光譜分布范圍極寬泛。如只選擇最大發射峰檢測而濾掉其他波段的信號,則會造成發光信號大量損失。此外,真核生物來源細胞、組織等不發光或樣品自身的背景熒光信號極低。故在螢光素酶檢測中,應盡可能地收集整個可見光譜(380–650 nm)信號,避免使用光柵、濾光片裝置濾除來自樣品信號,以確保檢測的靈敏度。這是DLR檢測跟魯米諾類衍生物的酶促反應發光等其他化學發光、BRET/NanoBRET生物發光等檢測上的重要區別。

在DLR檢測中用GloMax 20/20測定的海腎螢光素酶、螢火蟲螢光素酶的線性動態范圍.jpg

       DLR檢測的化學反應過程中,海腎螢光素酶與螢火蟲螢光素酶催化反應的發光信號強度有效范圍一般可達6-8個數量級。

       資料顯示,使用純化的螢火蟲和海腎螢光素酶混合物、Promega GloMax 20/20發光檢測儀測量發光信號,螢火蟲螢光素酶報告基因酶的檢測極限為1×10-21 mol螢光素酶,海腎螢光素酶的檢測限約3×10-19 mol海腎螢光素酶。

表1 Promega公司發光檢測儀的測試性能參數

型號

GloMax Navigator

GloMax Explorer

GloMax 96

GloMax 20/20

檢測器

head-on PMT

PMT

測定樣品類型

96-well plate

6~384-well plate

96-well plate

1.5mL tube

讀取位置

Top-read

Bottom-read

檢測發光類型

Glow/Flash

波長范圍

350~700nm

350~650nm(峰值420nm)

檢測下限

1.5×10-21

(mol熒光素酶)

3.0×10-21

(mol熒光素酶)

1.2×10-21

(mol熒光素酶)

檢測動態范圍

>9   logs

>8 logs

孔間光串擾

<3×10-5 (96孔白板)

/

注射器數量

2

1或2個 (可選)

注射器移液范圍

5~200μl (±1μl)

25~250μl (±1μl)

25~250μl (±3μl)

       表1顯示:Promega自創各型號發光檢測系統,PMT的感光波長范圍達到了350–700nm,測試線性范圍至少覆蓋8個數量級,測試靈敏度低至1×10-21 mol熒光素酶(約0.002 amol/well,96孔)。

       此外,DLR檢測需在白色多孔板上進行,是為更好地收集發光信號,并減少孔間信號的竄擾。

       同時,無論是基于光柵光路還是基于濾光片光路的發光檢測系統,都不適用于DLR檢測。

表2  品牌微孔板測讀儀發光檢測性能參數

品牌

型號

BMG

Lumistar Omega

BMG

Fluostar Omega

MD

SpectraMax Mini

BioTek

Synergy LX

DLR認證

檢測器

Side-on PMT

Side-on PMT

-5℃ PMT

PMT

測定樣品類型

6-384-well plate

6-384-well plate

6-384-well plate

6-384-well plate

讀取位置

Top/bottom read

Top/bottom   read

Top read

Top-read

檢測發光類型

Glow/Flash

Glow/Flash

Glow

Glow

波長范圍

240~740 nm

240~740 nm

300~650 nm

320~700nm

檢測下限

(mol 熒光素)

20 amol/well ATP

20 amol/well ATP

2 pmol/well ATP

2 pmol/well luciferase

檢測動態范圍

>9 logs

>9 logs

>7 logs

>6 logs

孔間光串擾

/

/

<0.1% (半量96孔白板)

/

注射器數量

2

2

NA

/

注射器移液范圍

3–500μl (±1μl)

3–500μl (±1μl)

NA

/

       對比表2所列的幾款發光酶標儀、多功能熒光酶標儀在發光測定的性能指標可發現,因檢測器線性動態響應范圍、檢測靈敏度差異,并非市面所有多模式微孔板檢測儀都可勝任DLR檢測。

       Promega 推薦使用經DLR認證的檢測系統(帶有 DLReady標識,系統軟件整合了標準DLR檢測應用程序)進行DLR檢測。無論是單管發光檢測儀或微孔板發光讀板儀,建議配備兩個試劑進樣器,以實現兩種試劑交替操作的無縫銜接。

 

三、用作DLR檢測的多功能熒光酶標儀經濟型方案

       目前,市面取得DLReady認證的發光檢測儀、發光酶標儀類產品屈指可數。

       物以稀為貴。

       無論一次只能進行單管測定的GloMax 20/20,還是可以96孔板批量測定的GloMax Navigator發光酶標儀,都售價不菲。國內公開信息顯示,GloMax Navigator售價高達4萬美元,已跟經典濾光片光路類多功能熒光酶標儀市價比肩。

       因此,購置GloMax Navigator發光酶標儀,則不如考慮帶熒光、發光和光吸收功能的且具有DLReady認證的多功能熒光酶標儀(注:有數十個機型可用,詳見promega英文網站有關內容)。

表3  部分DLReady認證的品牌多功能熒光微孔板測讀儀

品牌

型號

BMG

Fluostar Omega

MD

SpectraMax iD3

Tecan

Infinite F Plex

BioTek

Synergy HTX

外觀

Fluostar Omega多功能熒光酶標儀.jpgSpectraMax iD3多功能熒光酶標儀.jpgInfinite F Plex.jpgSynergy HTX多功能熒光酶標儀.jpg

檢測器

Side-on PMT

-5℃ PMT

PMT

PMT

測定樣品類型

6-384-well plate

6-384-well plate

6-384-well plate

6-384-well plate

讀取位置

Top/Bottom read

Top-read

Top-read

Top-read

檢測發光類型

Glow/Flash

Glow/Flash

Glow/Flash

Glow/Flash

波長范圍

240~740 nm

300 - 650 nm

/

300~700nm

檢測下限

(mol 熒光素)

20 amol/well ATP

10 pmol/well ATP

225 amol ATP/well

(9 pM;384孔板)

60 amol ATP/well

檢測動態范圍

>9 logs

>7 logs

/

>6 logs

孔間光串擾

/

<0.1% (半量96孔白板)

<0.1% (半量96孔白板)

/

注射器數量

2

2

2

2

注射器移液范圍

3~500μl (±1μl)

1~max (±1μl)

最大800μl (±1μl)

5~1000μl (±1μl)

       表3所列4個機型中,Tecan Infinite F200 PRO系列Infinite F Plex為單一濾光片光路架構,同時具有熒光、熒光偏振、發光檢測功能的熒光酶標儀(無光吸收測定功能)。

       BMG Fluostar OmegaBioTek Synergy HTX均為雙光路架構,即同時具有光柵光路(用于光吸收測定)、濾光片光路(用于熒光、發光檢測,其中濾光片輪中預留有發光檢測專用的空濾光片位,避免了濾光片對發光型號的過濾阻攔)。

       MD SpectraMax iD3與Fluostar Omega、Synergy HTX不同,其光吸收、熒光檢測波長的選擇是由光柵單色器(而非后二者采用的經典濾光片光路)完成的,發光檢測模塊則采用了單獨檢測光路。

       基于《熒光強度檢測的多功能熒光酶標儀方案-下》的觀點,采用相同功能配置時,SpectraMax iD3的售價將會高于Fluostar Omega、Synergy HTX市價。而Infinite F Plex,盡管采用的是濾光片光路,但因FP功能模塊存在,市價將絕非四款機型中的較低者。

 

參考文獻:

[1]E1910 和E1960 Dual-Luciferase Reporter Assay System 技術手冊中文版(2020,CTM040)

[2]GloMax 20/20 Luminometer Instructions For Use (Rev 11/12)

[3]GloMax Explorer System Operating Manual (Rev 6/22)

[4]Omega Family of Readers Operating Manual (Rev G)

[3]Instructions for Use for Infinite 200 PRO(Rev 1.6)

[5]SpectraMax Mini Multi-Mode Microplate Reader User Guide (5090339 B)

[6]SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader User Guide(5054747 H)

[7]Synergy HTX Operator's Manual (Rev A)

[8]Simon T.M. Allard,  Kevin Kopish. Luciferase Reporter Assays: Powerful, Adaptable Tools For Cell Biology Research. Cell Notes, 2008, Issue 21.

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