<nobr id="ek4by"><xmp id="ek4by"><var id="ek4by"></var><td id="ek4by"></td><label id="ek4by"></label><rt id="ek4by"><rt id="ek4by"><var id="ek4by"></var></rt></rt><xmp id="ek4by"><video id="ek4by"><nobr id="ek4by"></nobr></video><video id="ek4by"><nobr id="ek4by"></nobr></video><rt id="ek4by"><xmp id="ek4by"><video id="ek4by"></video> <rt id="ek4by"><nobr id="ek4by"></nobr></rt><label id="ek4by"><rt id="ek4by"></rt></label><nobr id="ek4by"><rt id="ek4by"><xmp id="ek4by"> <nobr id="ek4by"></nobr><xmp id="ek4by"><xmp id="ek4by"><xmp id="ek4by"><var id="ek4by"></var>

百家秘籍

撥開云霧見月明——英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術特點解析-4

iBright FL1500 藍綠透射光源的檢測應用

       Western Blot熒光成像分析儀的江湖上,伯樂ChemiDoc MP、GE Amersham ImageQuant 800 Fluor(AI800 Fluor)、耶拿UVP ChemStudio Plus和賽默飛Invitrogen iBright FL1500這四雄,要論硬件配置上最顯著的區別,恐怕是非透射光源(Transilluminator)莫屬。因為,伯樂、UVP的系統用了經典302nm的透射紫外臺(Trans-UV);AI800 Fluor默認裝備是LED透射白光(LED trans-white),當然可以選配AI800 UV升級模塊;而iBright FL1500標配是一臺LED藍綠光透射儀(green-LED transilluminator)。

       很明顯,GE主打Western+蛋白凝膠圖像分析,Bio-Rad和UVP是要兼顧核酸、蛋白凝膠成像需求,而Thermo Fisher則意圖實現凝膠類等透明樣品的激發、照明多樣化檢測。那iBright FL1500的這一設計究竟是銳意創新的結晶,還是嘩眾取寵的敗筆?這一問題值得探討。

 

一、透射藍綠色光源在核酸凝膠檢測中應用的表現

       根據文獻報道和廠商使用說明,對4大類核酸常用熒光染料標記凝膠成像激發方案匯總后,可獲得表1所列信息。

表1 常見核酸熒光染料激發波長列表

樣品類型

Trans-green (490–520nm)

Trans-UV (280–320nm)

核酸凝膠

Ethidium Bromide (EB)

● (518 nm)

●● (302 nm)

GelRed

● (488 nm)

●● (302 nm)

GelSafe

● (514 nm)

●● (309 nm)

GelGreen

●● (500 nm)

● (302 nm)

SYBR Gold

●● (495 nm)

● (302 nm)

SYBR Safe (DNA)

●● (502 nm)

● (302 nm)

SYBR Green I (dsDNA)

●● (497 nm)

● (302 nm)

SYBR Green II (RNA)

●● (497 nm)

● (302 nm)

Goldview/AO (>1 kb DNA)

●● (491 nm)

●● (294 nm)

       科研實驗中不少熒光試劑,在紫外、藍光波長下都有強度不等的吸收峰。理論上,可使用其中任何一種光源激發。

       以溴化乙錠(EB)為例,它的激發峰有兩個:波長300 nm最大激發峰(主激發峰)和波長518nm次激發峰,次激發峰強度明顯低于紫外波長激發峰。藍綠光透射儀雖然可以有效激發EB,而且經1.25kb基因擴增產物瓊脂糖凝膠成像對比證明,用302nm紫外光透射儀激發和基于iBright FL1500 Western成像分析儀檢測,所獲凝膠圖像效果極其接近。                                              

iBright FL1500 藍綠透射光源用于EB凝膠的檢測.jpg


       廠商發布的熒光染料技術資料中推薦的激發波長,素有主激發峰波長、可用激發波長(次激發波長)之分。在主、次激發波長的條件下,熒光基團發光強度有差異,使得相同曝光時間內,凝膠的中、低豐度樣品條帶的圖像信號表現可能不一致。若成像條件未經優化,為強化弱信號條帶檢測而延長曝光時間,不僅會引入更多圖像背景噪音成份,還可能造成強信號條帶過飽和,高中低信號條帶強度對比失真。而基于過度曝光的圖像信號定量條帶樣品含量,不符合ImageJ指南關于圖像分析中運用朗伯-比爾定律的條件。

       一般情況下,采用熒光試劑最大激發峰波長檢測,具有更好信噪比,有助于提高檢測靈敏度。因此,樣品豐度的定量分析應基于染料的主激發波長測定,而定性分析(如樣品分子量對比鑒定)可以采用次激發波長檢測。

       整體上,波長490-520 nm藍綠光透射儀與凝膠成像分析儀標配302nm透射儀(波長范圍280–320nm,輻射能量峰波長302nm),二者可激發的熒光染料種類基本重疊。

       對兩種文獻報道中常用的核酸相對定量分析染料SYBR Gold、SYBR Green的激發效果,藍綠色激發光顯然更優。而302nm紫外則最適于溴化乙錠EB、GelRed 和GelSafe的檢測。

       Gel Safe類核酸安全無毒染料,雖兼容藍光、紫外兩種激發波長,但基因克隆實驗中,藍綠光照射可避免凝膠觀察和切膠過程中,人體和樣品的紫外線暴露損傷風險。故GelRed、GelSafe等染料在實際使用中,更多的是基于藍綠光而非紫外線來檢測。何況,LED光源使用壽命比紫外燈長,無須定期更換,節省管理維護成本。

       因此,核酸凝膠檢測應用,iBright FL1500的490-520nm波長透射儀配置方案要優于常規紫外透射儀。

 

二、藍綠色透射儀在蛋白檢測中的應用

       生物醫學實驗中蛋白樣品類型多樣,手工和預制SDS-PAGE凝膠,常規免染型凝膠和基因克隆平板都是常用樣品。

       蛋白免染凝膠熒光的應用,iBright FL1500熒光成像儀不支持伯樂的蛋白免染凝膠檢測,只能使用英捷免染熒光試劑。這一點在《英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術特點解析-2》已有討論。

       有文獻報道了用iBright FL1500 的LED藍綠光透射儀從底部照射搭載有GFP基因的克隆培養板,對靶蛋白表達克隆進行快速篩查和克隆熒光計數分析。

表2  透射藍光與302nm紫外激發的蛋白凝膠熒光染料對比表

樣品類型

Trans-green (490–520nm)

Trans-UV (280–320nm)

蛋白凝膠

SYPRO Ruby (總蛋白)

● (460 nm)

●● (280 nm)

SYPRO Red (總蛋白)

●● (520 nm)

● (300 nm)

SYPRO Tangerine (總蛋白-WB)

●● (490 nm)

●● (300 nm)

Oriole (總蛋白)


●● (302 nm)

Flamingo火烈鳥(總蛋白)

●● (490-520 nm)


Pierce Krypton (總蛋白)

●● (520 nm)


Pro-Q Diamond (磷酸化蛋白)

●● (520 nm)


Pro-Q Emerald 300 (糖基化蛋白)


●● (302 nm)

Pro-Q Emerald 488 (糖基化蛋白)

●● (510 nm)


InVision His-tag (His標簽蛋白)

●● (LED白光板替代)

●● (302 nm)

免染熒光應用

支持總蛋白定量分析

●● (英捷no-stain試劑)

●● (伯樂Stain-free膠)

菌落平板

GFP表達克隆篩查

●● (490 nm)


       表2數據顯示:蛋白凝膠熒光檢測應用,490-520nm藍綠光和302nm透射儀的適用性各有千秋。用于凝膠總蛋白、翻譯后修飾蛋白的定量分析的常用熒光染料檢測的支持方面,兩種透射光源都存在短板,難以有效覆蓋全部應用。相對而言,透射藍綠光源的兼容性更好。

       這給了我們一個有益的啟示:在考慮蛋白凝膠成像分析系統配置中,如有可能,應將紫外、藍光兩種透射光源相結合,可極大提升系統蛋白凝膠檢測應用的靈活性。

       iBright FL1500只能裝配藍綠透射儀,無紫透射外臺可供升級。而ChemiDoc MP、UVP ChemStudio Plus可以在標配基礎上加配藍光屏或LED透射藍光臺(trans-blue),通過搭配,兩種檢測光源取長補短,相得益彰,實現檢測功能擴展的自由。

 

三、小結

       作為一款主要定位于Western blot實驗印跡熒光、化學發光ECL檢測的高端成像分析儀, Invitrogen iBright FL1500通過引入藍綠透射光源和白光板這套配置,實現了對核酸凝膠、蛋白凝膠的熒光、可見光檢測分析的有效兼顧,從技術層面來說無疑非常成功。

       正所謂尺有所短寸有所長,iBright FL1500不可能是完美無缺的杰作。

       首先,在核酸凝膠檢測上,由于官方只證實藍綠透射儀可以有效支持EB標記染料的成像分析,但缺少EB染料標記核酸定量檢測動態線性范圍,以及這一線性范圍與基于標準302nm波長檢測條件下動態范圍的對比數據。當用于高濃度的核酸樣品(如PCR擴增產物)、低豐度樣品(低表達mRNA)和稀有珍貴樣品的定量分析時,若無相應驗證過程,則數據可靠性難免存疑。

       其次,在蛋白凝膠檢測上,iBright FL1500藍光透射儀可支持總蛋白檢測、修飾后蛋白檢測,但依然存在對Oriole (總蛋白檢測) 、Pro-Q Emerald 300 (糖基化蛋白檢測)等染料不兼容的問題。

       此外,不支持已廣泛應用的伯樂免染凝膠熒光的檢測。

 

參考文獻:

[1]Luca Zinzula, Angela Maria Mereu, Massimiliano Orsini, et al. Ebola and Marburg virus VP35 coiled-coil validated as antiviral target by tripartite split-GFP complementation. iScience. 2022 Nov 18; 25(11): 105354.

[2]Anna Lipońska, Mee-Ngan F. Yap. Hibernation-Promoting Factor Sequesters Staphylococcus aureus Ribosomes to Antagonize RNase R-Mediated Nucleolytic Degradation. mBio. 2021 Jul-Aug; 12(4): e00334-21.

[3]Nan-Kai Wang, Pei-Kang Liu, Yang Kong, et al. Mouse Models of Achromatopsia in Addressing Temporal “Point of No Return” in Gene-Therapy. Int J Mol Sci. 2021 Aug; 22(15): 8069.

[4]tephen D. Willis, Sara E. Hanley, Steven J. Doyle, et al. Cyclin C-Cdk8 Kinase Phosphorylation of Rim15 Prevents the Aberrant Activation of Stress Response Genes. Front Cell Dev Biol. 2022; 10: 867257.

[5]Minjie Zhang, Kongpan Li, Jianhui Bai, et al. Optimized photochemistry enables efficient analysis of dynamic RNA structuromes and interactomes in genetic and infectious diseases. Nat Commun. 2021; 12: 2344.

[6]C.G. Piett, T.J. Pecen, D. J. Laverty, et al. Large-scale preparation of fluorescence multiplex host cell reactivation (FM-HCR) reporters. Nat Protoc. 2021 Sep; 16(9): 4265–4298.

[7]Ben E Clifton, Muhammad A Fariz, Gen-Ichiro Uechi, et al. Evolutionary repair reveals an unexpected role of the tRNA modification m1G37 in aminoacylation. Nucleic Acids Res. 2021 Dec 2; 49(21): 12467–12485.

[8]ImageJ User Guide (IJ 1.46r).
[9]GoldView Nucleic Acid Dyes User Guide(sultanggroup).
[10]GELSAFE Nucleic Acid Gel Stain User Guide(Danagen).
[11]GelRed & GelGreen DNA Stains Catalogue (Biotium).
[12]InVision His-tag In-gel Stain User Guide(Invitrogen). 

久久精品国产最新地
<nobr id="ek4by"><xmp id="ek4by"><var id="ek4by"></var><td id="ek4by"></td><label id="ek4by"></label><rt id="ek4by"><rt id="ek4by"><var id="ek4by"></var></rt></rt><xmp id="ek4by"><video id="ek4by"><nobr id="ek4by"></nobr></video><video id="ek4by"><nobr id="ek4by"></nobr></video><rt id="ek4by"><xmp id="ek4by"><video id="ek4by"></video> <rt id="ek4by"><nobr id="ek4by"></nobr></rt><label id="ek4by"><rt id="ek4by"></rt></label><nobr id="ek4by"><rt id="ek4by"><xmp id="ek4by"> <nobr id="ek4by"></nobr><xmp id="ek4by"><xmp id="ek4by"><xmp id="ek4by"><var id="ek4by"></var>