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操作規程

大腸桿菌質粒DNA的提取純化方案

質粒是獨立于染色體的環狀DNA分子。在分子生物學中,他們被用作運送分子,或稱載體,用于承載特定的DNA片段。

利用細菌來復制質粒,可以大規模生產目的DNA。從細菌中獲得質粒的方法稱為質粒純化。

質粒純化是將質粒DNA與基因組DNA、蛋白質、核糖體以及細菌細胞壁分離開的一種技術。

質粒純化包括三個基本步驟:細菌的培養,細菌的收集和裂解,質粒DNA的純化。

實驗材料:含質粒的大腸桿菌

試劑、試劑盒:葡萄糖 EDTA Tris-HCl NaOH SDS KAc 異戊醇

儀器、耗材: 臺式高速離心機 、 恒溫振蕩搖床  、高壓滅菌鍋  、振蕩器 、 微量移液器 、 1.5ml離心管 (點擊藍色字體可查看相關產品)

實驗步驟

大腸桿菌質粒DNA的提取純化方案

 大腸桿菌質粒DNA的提取純化方案

純化完成后,有許多方法可用來檢驗質粒的純度,以確認質粒沒有被基因組DNA污染并且沒有在細菌內被修飾。

分光光度計可以通過比較在不同波長條件下的吸光度來測定質粒DNA的濃度。(點擊藍色字體可查看相關產品)

瓊脂糖凝膠電泳也可用來分析質粒DNA的大小是否正確或者是否有雜質。(點擊藍色字體可查看相關產品)

應用和改動

對于不同的質粒大小、拷貝數、和培養體積,可相應改動該質粒純化過程,包括使用不同的結合,清洗和洗脫設備。其中最主要的區分標準是質粒產量,它將質粒制備劃分為微量提取,中量提取,大量提取和超量提取。

關于下游的應用,質粒純化后通常會被用于一種叫做轉染的技術,它是將質粒DNA轉入到真核細胞當中。多數時候,轉染的目的是利用報告蛋白來觀察細胞或組織的結構。

有時,分別純化的多個質粒會被轉入到同一細菌當中,這些質粒編碼幾種酶,從而在細菌中再造形成一個完整的生物合成途徑。最終結果是合成一種復雜的化合物,例如抗生素。

純化的質粒也可能用來重新轉化細菌,用于大量生產該質粒編碼的蛋白質。然后結晶純化的蛋白來進行結構分析。


參考資料:

《醫學生物化學與分子生物學實驗技術雙語教程》和《微生物學實驗》 


 

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