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操作規程

實時熒光定量PCR實驗注意事項

1.在實驗過程中要防止 RNA 的降解,保持 RNA 的完整性。在總 RNA 的提取過程中,注意避免 mRNA 斷裂。
2.為了防止非特異性擴增,必須設陰性對照。
3.內參的設定:主要為了用于靶 RNA 的定量。常用的內參有 G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免 RNA 定量誤差、加樣誤差以及各 PCR 反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
4.PCR 不能進入平臺期,出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標 DNA 起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數,均應通過單獨實驗來確定。
5.防止 DNA 的污染:采用 DNA 酶處理 RNA 樣品,在可能的情況下,將 PCR 引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA 的共線性。
6.所有的玻璃器皿均應在使用前于 180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
7.塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。
8.有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在 3% H2O2 室溫 10min,然后用 0.1% DEPC 水沖洗,晾干。
9.配制的溶液應盡可能的用 0.1% DEPC,在 37℃處理 12hr 以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應當用DEPC 處理過的無菌雙蒸水配制,然后經0.22μm濾膜過濾除菌。
10.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實驗過程中手套要勤換,盡量避免其他人員干擾。
11.設置 RNA 操作專用實驗室,所有器械等應為專用。
12.DEPC 是蛋白質強變性劑,它和 RNA 酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制酶活性。具強揮發性,致癌物,因而使用時應在通風櫥操作,需戴一次性手套,一次性口罩,小心操作。
13.RT試劑盒從冰箱拿出,應該充分解凍,瞬離后,混勻,放于冰上,可在冰上加樣。試劑可以用數字貼紙編號,避免漏加、錯加試劑。
14.取用不同的試劑時,必須更換槍頭,樣本之間要避免交叉污染。
15.逆轉錄時,PCR儀可以先預熱。
16.反應體系配好之后,應充分混勻,瞬離,并且彈去管內的氣泡。
17.實驗過程中應預防RNA酶污染,使用無酶槍頭以及EP管,同時臺面可以使用固相RNA酶去除劑清潔。
18.PCR時,管壁盡量避免寫字。
19.管蓋一定要蓋嚴。
20.10μL逆轉錄反應體系建議加入不超過500ng的RNA。
21.如果目的基因表達量非常低,最多加入1μg Total RNA,否則加入RNA量過高,可能會超出后續PCR的線性范圍。
22.反應體積可根據需要等比例放大。
23.試劑盡量不要反復凍融。
24.每個樣品至少3個平行孔,所有成分加完后,離心去除氣泡。
25.可將所有共同物質加入同一管中,混勻后分散入其他管中。



 

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